Наука

Как масово се произвежда иРНК (ваксината)?

С новината, че в България ще бъдат доставени ваксини на Pfizer хората разбраха, че ще се докоснат до технология, която не е особено добре позната поне по нашите балкански ширини, защото е прекалено модерна, а с това възникват и естествените въпроси за ефективността и безопасността и. Новият метод се основава на основната парадигма в молекулярната биология: ДНК – РНК – протеин. Плазмидна ДНК се използва за синтез (транскрипция) на информационна РНК, която се инжектира в мускулна тъкан, където чрез класически процес на транслация се произвежда самият протеинов антиген. Истината е, че това не е съвсем нова технология, а някои нейни преимущества са отговорни именно за бързото разработване на новата ваксина.

Типове ваксини и преимуществото на mRNA

Много хора отказват да приемат модерните ваксини, които съдържат само пречистени клетъчни компоненти, които предизвиква имунния отговор, а не са носители на цяла клетка или вирус. Те живеят във времената на Пастьор с идеята, че във ваксината трябва да има нещо живо, за да е истинска ваксина. Към момента вариациите са толкова много. Ваксината може да съдържа атенюиран жив щам, може да съдържа убит (най-често химически) патоген, може да съдържа отделен пречистен протеин, а в случая може да съдържа просто една къса верига РНК. Но истината е, че класическите методики за производство могат да са понякога много трудоемки и времеотнемащи.

Да вземем пример технологията за производство на ежегодната ваксина против сезонен грип. Производството и може да отнеме повече от 6 месеца. Първо се започва с идентифициране на кои точно щамове ще циркулират в конкретния регион пред идната година. Все пак, ако ваксината съдържа неправилните щамове, тя няма да е никак полезна. Втората стъпка е дивият грипен вирус да се адаптира за производство на новата ваксина. Това се случва чрез съвместното култивиране на дивия щам с лабораторен, при което се създава атенюиран хибрид. Тази стъпка отнема около 3 седмици. Следващата стъпка е стъпка на верификация. Трябва да се докаже, че новият хибрид наистина синтезира нужния повърхностен протеин, който в случая играе ролята на антиген, отговорен за създаване на имунния ни отговор. И тази стъпка отнема около 3 седмици. В последствие следва оптимизация на условията на растеж на ваксиналния щам – 3 седмици. Следващата стъпка е производство на самия антиген. Това става чрез инфектиране на вирусно чисти оплодени яйца на възраст 9-12 дни. Хиляди яйца се инокулират с посевна култура на вируса. В последствие се събира алантоисната течност от яйцата, в която се намират новосинтезираните вирусни частици, а те допълнително се инактивират (убиват) чрез химични агенти. Всяка нова партида отнема около 2 седмици за произвеждане. След производството естествено следва качествен контрол, за да се определи дали антигенът е чист или е замърсен с други патогени – 2 седмици. Ако всичко е добре, се извършва пълнене на флакони или други материали за съхранение. Това е краен продукт, който отново подлежи на качествен контрол – определяне на стерилност, определяне на концентрация, определяне на безопасност. Последната стъпка изисква и клинични изпитвания преди официално да бъде пусната на пазара (Източник 1).

Класическата алтернатива (макар и това да е доста иновативен метод) на иРНК ваксините са чистите протеинови ваксини – ваксини, които съдържат само и единствено протеина, който е антиген. Тук производственият процес дори е по-сложен и трудоемък, защото освен, че трябва да култивираш патогена (както по-горе бе описано с грипния вирус), в последствие трябва да го лизираш (да го разкъсаш, за да освободиш търсения протеин), да премахнеш клетъчните компоненти, да пречистиш твоя търсен протеин от всички останали и много често дори се налага да смениш средата, в която е разтворен вече пречистения протеин. Всичко това не просто отнема време, а всяка технологична стъпка изисква огромен финансов ресурс.

иРНК ваксините обаче предоставят едно изключително ценно предимство – те прескачат голяма част от тези ненужни технологични стъпки, с което се пести време и пари. Няма нужда да изолираш патогени, няма нужда да създаваш хибриди, няма нужда да ги култивираш, няма нужда да създаваш лизати или да извършваш множество сложни пречиствания.

История на иРНК технологията

Всъщност иРНК технологията не е нещо чак толкова модерно. Просто в момента се въвежда масово в употреба. За пръв път през далечната 1990 година (когато всъщност съм роден) се доказва, че може да се инжектира информационна РНК в мускулна тъкан на животни, при което да се предизвика желан синтез на протеини (Източник 2). Три години по-късно се доказва, че можеш да обвиеш иРНК в малка липозома (настоящата ваксинална технология на Pfizer и moderna), за да я направиш по-стабилна и да я защитиш от външните условия. Това е направено с иРНК, кодираща нуклеопротеин на грипния вирус, при което след инжектиране доказано е предизвикан специфичен T-клетъчен отговор (Източник 3). Използват се липозоми, защото се установява, че голи РНК-и просто не успеят да предизвикат този желан имунен отговор, защото най-вероятно са прекалено нестабилни и се разграждат в тялото при самото инжектиране.

През 2000 година бе демонстрирано нещо епохално. Тогава за пръв пет бе показано, че изолирана информационна РНК от туморни S1509 клетки може да предизвика имунитет (Източник 4). Това дава началото на нова методика за лечение и превенция на онкологични заболявания. През 2007 година бе показана концепцията за ваксина против меланоми – MART1 иРНК би могла да предотврати развитието и метастазирането на В16 меланома (Изтоник 5). Към момента в модерни изследователски клиники се използва друга интересна технология за РНК ваксина против рак – инжектиране на епителни или други клетки, които са предварително трансфектирани с тотална РНК, изолирана от туморни клетки (Изтоник 6). Така смело може да се стигне до заключението, че човечеството има 2 десетилетия опит с РНК ваксините, макар и при превенцията и лечението на онкологични заболявания. А този метод дава доста обещаващи резултати. Най-вълнуващото е, че в бъдеще може би ще имаме рутинна, бърза и евтина технология за създаване на персонализирани РНК ваксини – пациентът постъпва в клиниката, където се изолира РНК от туморните му клетки, за да се превърне в персонализирана ваксина.

Интересното в случая на moderna е, че това е компания, която има всъщност доста солиден опит в иРНК технологиите. Те от години развиват тяхна специализирана платформа за развитие на продукти, насочени към имуноонкологията, лечение на редки (генетични) заболявания, а в настоящата пандемия и инфекциозни заболявания. иРНК платформата може да се окаже универсален инструмент, който може да се използва в множество различни полета на молекулярната, персонализирана медицина.

А как реално се произвежда иРНК, използвана за ваксина?

Индустриалният процес на синтез на ваксинална иРНК не изисква жив вектор – вирус или бактерии или пък живи клетки за синтез на клетъчни компоненти. Методът е по-скоро in vitro биохимичен синтез – не изисква живи клетки или жива материя. Във воден разтвор на нуклеотиди (градивните елементи на РНК) се поставя матрицата за синтез на иРНК – плазмидна ДНК. Предварително проектираната плазмидна ДНК, която носи информацията за синтез на иРНК трябва да бъде пречистена, защото в естествени условия може да съществува в три състояния – суперспирализирана рДНК, отпусната кръгова рДНК и линейна рДНК. За производство на ваксината е нужна линейна плазмидна ДНК. Самият биосинтетичен процес се извършва от изолирани чисти ензими – в разтвора се добавя и РНК полимераза от бактериофаги (T7, T3 или SP6). Това са ДНК зависими РНК полимерази, което означава, че това са ензими, които синтезират нови полимерни РНК молекули като ползват за шаблон предоставената плазмидна ДНК и разтворените нуклеотиди като градивни елементи (субстрат). Така след известно време този биокаталитичен процес би произвел нужното количество иРНК, която да се развасофка в крайния продукт.

Тънкият момент тук е, че иРНК предварително трябва да се проектира по начин, който да наподобява не на вирусна, а на човешка РНК. Затова при създаване на шаблона (плазмидната ДНК) се задават “инструкции” иРНК да бъде кепирана в началото на молекулата, в последствие трябва и да се метилира, а в края и да има полиА опашка (множество повторения (А)денин). Тези елементи правят иРНК безопасна за ваксинирания и по-стабилна, когато навлезе в цитоплазмата на човешките клетки.

След успешния синтез се получава разтвор, който съдържа много компоненти – отделни нуклеотиди, ензими, използваната плазмидна ДНК, нужната ни иРНК, дефектна по-къса РНК или дефектна по-дълга РНК. Най-лесният начин за пречистване, който се прилага в производството е някаква форма на селективно преципитиране (утаяване) и/или хроматографско разделяне по размер (SE-(H/F)PLC). При него пробата се нанася в дълга колона с хроматографска смола, която специфично разделя молекулите в пробата по размер като сито (нарича се още молекулно-ситова хроматограия). Така е възможно да се изолира иРНК с правилната дължина. Освен това е доказано, че добре пречистената по този начин иРНК води до по-успешен и силен синтез на протеиновия антиген. Тази силна транслационна активност се дължи просто на премахването на всякакви замърсители.

Последната стъпка при производството на продукта е формулирането. Чистата иРНК е заплашена на бързо деградиране, особено при замърсяване с екстрацелуларни (външни) РНК-ази (ензими, котио разхраждат РНК). Затова ефективността на една подобна ваксина би се повишила, ако иРНК е обвита в защитен материал. В случая на ваксината на Pfizer тази иРНК е поместена в малки липозоми – празни сфери, изградени от липиди. Липидите, за разлика от други материали за наночастици, са биологично съвместими и разградими.

Какво знаем за безопасността на тази технология?

Преди да говорим за каквито и да е рискове, трябва да не забравяме, че е напълно естествено човешките клетки да произвеждат протеини от чужди и неестествени РНК-и. Това е и целият смисъл на вирусната инфекция – навлиза чужда частица в нашите клетки, които освобождават чужда генетична информация, от която се синтезират непознати иРНК, а в последствие и нетипични за нас вирусни протеини.

Съществуват и развити технологии за ДНК ваксини, но предимството на иРНК (пред наличните ДНК ваксини) е, че това е генетичен елемент, който няма контакт с ДНК и не може да се интегрира в генома ни, не се реплицира в клетките ни и сигурно ще бъде разграден до няколко дни. Според някои изследователи, които описват начини за синтез на РНК ваксини, няма описани автоимунни реакции към този тип препарати. Няма и абсолютно доказани опасни странични ефекти.

В литературата има описани клинични изследвания върху хора с иРНК ваксини за други инфекциозни заболявания. Така например в Германия 101 добролеца са получили 3 дози в продължителен период от време на иРНК ваксина против бяс. Резултатите показват, че успешно се образува имунен отговор към синтезирания в мускулните клетки антигени и не са били наблюдавани сериозни странични ефекти, различни от типичните и очакваните за една ваксина (Източник 8).

Най-голямото опасение за тази ваксина е нейното съхранение и транспортиране. За РНК е от огромно значение тя да се съхранява при минусови температури, за да не деградира. Ако това се случи, би означавало, че хората биха инжектирали в себе си просто разтвор на безполезни нуклеотиди, които няма да доведат до имунен отговор.


Цитирана литература:

Източник 1: https://www.who.int/news/item/06-08-2009-pandemic-influenza-vaccine-manufacturing-process-and-timeline

Източник 2: Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Wolff JA, Malone RW, Williams P, Chong W, Acsadi G, Jani A, Felgner PL Science. 1990 Mar 23; 247(4949 Pt 1):1465-8.

Източник 3: Induction of virus-specific cytotoxic T lymphocytes in vivo by liposome-entrapped mRNA. Martinon F, Krishnan S, Lenzen G, Magné R, Gomard E, Guillet JG, Lévy JP, Meulien P Eur J Immunol. 1993 Jul; 23(7):1719-22.

Източник 4: Induction of anti-tumor immunity with epidermal cells pulsed with tumor-derived RNA or intradermal administration of RNA. Granstein RD, Ding W, Ozawa H J Invest Dermatol. 2000 Apr; 114(4):632-6.

Източник 5: mRNA-based cancer vaccine: prevention of B16 melanoma progression and metastasis by systemic injection of MART1 mRNA histidylated lipopolyplexes. Mockey M, Bourseau E, Chandrashekhar V, Chaudhuri A, Lafosse S, Le Cam E, Quesniaux VF, Ryffel B, Pichon C, Midoux P Cancer Gene Ther. 2007 Sep; 14(9):802-14.

Източник 6: Induction of anti-tumor immunity with epidermal cells pulsed with tumor-derived RNA or intradermal administration of RNA. Granstein RD, Ding W, Ozawa H J Invest Dermatol. 2000 Apr; 114(4):632-6.

Източник 7: Generating the optimal mRNA for therapy: HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside-modified, protein-encoding mRNA. Karikó K, Muramatsu H, Ludwig J, Weissman D Nucleic Acids Res. 2011 Nov; 39(21):e142.

Източник 8: Martin Alberer, Ulrike Gnad-Vogt, Henoch Sangjoon Hong, Keyvan Tadjalli Mehr, Linus Backert, Greg Finak, Raphael Gottardo, Mihai Alexandru Bica, Aurelio Garofano, Sven Dominik Koch, Mariola Fotin-Mleczek, Ingmar Hoerr, Ralf Clemens, Frank von Sonnenburg, Safety and immunogenicity of a mRNA rabies vaccine in healthy adults: an open-label, non-randomised, prospective, first-in-human phase 1 clinical trial, The Lancet, Volume 390, Issue 10101, 2017, Pages 1511-1520, ISSN 0140-6736, https://doi.org/10.1016/S0140-6736(17)31665-3.

Хареса ли ти тази статия? Може да подкрепиш biologist чрез Patreon!
Share this Story
Load More Related Articles
Load More By biologist
Load More In Наука

Facebook Comments

Check Also

Какво знаем за новия щам SARS-CoV-2 VUI 202012/01

През последните няколко седмици в Обединеното кралство се ...

Facebook

Patreon

Ако харесвате съдържанието на biologist, може да го подкрепите чрез Patreon.!
shares